在选择CRISPR/Cas系统的递送技术之前，首先得确认Cas蛋白和sgRNA的生物形式，它有3种不同的生物形式能被递送至细胞内，分别是质粒DNA、mRNA和核糖核蛋白（RNP）形式。

pDNA（质粒DNA）是 CRISPR/Cas系统最常用的一种形式。以最主流的CRISPR/Cas9系统为例，首先设计CRISPR质粒DNA，包含启动子、Cas9基因序列、sgRNA序列等。之后通过转染技术，让质粒在NLS的帮助下进入细胞核，通过转录形成Cas9 mRNA和sgRNA，Cas9 mRNA被转移到细胞质中翻译成Cas9蛋白，随后Cas9蛋白与sgRNA结合形成复合物，启动后续的基因编辑。

近岸蛋白提供CRISPR质粒构建时需要的同源重组克隆试剂盒(Cat.No.NR005)，能做到1-5片段无缝克隆，最快仅需10min完成克隆连接，无假阳性，菌落数多。

mRNA形式的工作原理是通过体外转录技术（IVT）在体外合成Cas9 mRNA以及sgRNA，并进行化学修饰，包括5’端加帽、核苷酸修饰（如假尿苷修饰）及3’端Poly（A）尾等。mRNA直接进入细胞质，绕过转录步骤，由核糖体立即翻译为功能蛋白。同时递送的修饰sgRNA与新生Cas9快速组装成复合物，切割靶DNA。其优势在于瞬时表达，通过核苷酸修饰（如N1-甲基假尿苷）降低免疫原性，但需LNP等载体保护免受核酸酶降解。

近岸蛋白研发的Cas9 mRNA (N1-Me-Pseudo UTP) （Cat.No.MR019）不仅在N端和C端分别加入核定位信号NLS，提高DNA切割速率，并且加入N1-甲基假尿苷替换原有的UTP，有效降低mRNA在哺乳动物细胞中表达的免疫原性，增强mRNA的稳定性。

图例）Cas9 mRNA (N1-Me-Pseudo UTP)转染24h后，293T细胞中的编辑效果，细胞因Cas9活性发出绿色荧光，简单快速，mRNA转染效率稳定。

核糖核蛋白是指Cas9蛋白与sgRNA的复合物，又称为RNP。首先在体外合成Cas9蛋白和sgRNA，并将他们结合形成RNP复合物，之后作为单个货物直接通过电转或者脂质体等转染技术递送至细胞中，避免了与pDNA或mRNA递送相关的许多陷阱，如pDNA会有整合至基因组的风险，mRNA稳定性差等。RNP递送无需细胞内转录和翻译，因此可实现最快速的基因组编辑。

近岸蛋白专门为CRISPR/Cas系统的RNP体系开发的Cas蛋白及其突变体，不仅含有NLS核定位信号，蛋白纯度≥95%，活性高，体外切割效率达90%，内毒素低，能在72h内完全降解，可有效降低脱靶效应，提高基因编辑敲入或者敲除的效率。再加上通用型一步法sgRNA体外转录试剂盒（Cat.No.E399），快速制备CRISPR/Cas系统所需的两大元件，可以实现即时快速的基因编辑。

大家了解了CRISPR/Cas系统的生物形式，那么如何将这些不同的CRISPR/Cas系统生物形式递送至细胞中呢？这就需要通过不同的递送技术，包括物理转染法、化学转染法和病毒载体转染法。

01 显微注射法

显微注射法是指在显微镜下将微量的核酸通过专门的仪器注射到细胞的细胞质或细胞核中，从而实现核酸的导入。其操作流程是制备RNP体系/mRNA/Cas9质粒，使用显微注射仪注入细胞中，培养并分析编辑效率。该技术最重要的用途是将核酸引入卵母细胞、卵细胞和动物胚胎中，常用于制备转基因动物和基因瞬时表达分析。

02 电穿孔法

电穿孔法是将细胞暴露在短暂的高场强脉冲电场中，通过在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞的方法。其操作流程是将细胞与CRISPR组分（RNP或Cas9质粒）混合，加入电穿孔缓冲液，施加脉冲电压，即可瞬转至细胞中。脉冲的大小和持续时间决定了转染效率，对于不同的细胞系，必须经过优化验证来确定电转条件，该方法转染效率高，适用性广，不受细胞种类的限制，但是需要昂贵的仪器进行实验，且细胞死亡率较高。

电穿孔法瞬时转染原理图

（Du, Xiaofan & Zhou et al. 2018）

01 DEAE－葡聚糖法

DEAE-葡聚糖是最早开发的转染试剂之一。它是一种可溶的聚阳离子碳水化合物，通过与带负电的DNA结合形成聚集物。适用于Cas9质粒DNA的递送。携带正电荷的复合物与带负电荷的细胞膜结合，使复合物通过细胞的内吞作用进入细胞中。

02 磷酸钙法

该技术通过将磷酸盐溶液和含有DNA的氯化钙溶液进行缓慢混合，形成DNA-磷酸钙共沉淀复合物。适用于Cas9质粒DNA的递送。复合物能粘附于细胞膜上，通过细胞内吞作用进入细胞中。

03 阳离子脂质体法

脂质体分为单层脂质体和多层脂质体。常用的阳离子脂质体与带负电的DNA结合，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，通过细胞内吞作用进入细胞。其操作流程是将Cas9质粒或mRNA与脂质体混合，孵育形成脂质体-核酸复合物，加入细胞培养液，37°C孵育24-48小时，检测编辑效率。

脂质体瞬时转染原理图（Parker et al. 2003）

化学转染法能够在活体内应用，对细胞毒性较低且细胞存活率较高、实验重复性好。适用性广，已经被广泛用于将pDNA和mRNA转移到细胞中，在很多细胞中能得到有效的瞬时转染和稳定转染效果。但是该试剂有着难以自制，价格较为昂贵，转染效果在不同细胞类型中差异较大等缺点。

01 慢病毒

慢病毒载体系统是一种能非常高效地把外源基因稳定整合到哺乳动物细胞中的载体工具。除了常规质粒转染外，目前该系统也是把外源基因转入哺乳动物细胞的最常用方法之一。由于具有目的基因和启动子选择的灵活性以及转染细胞类型的广泛性两大特点，使其成为应用范围较广的外源基因表达系统。慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒HIV，属于逆转录病毒家族，而目前通过改造优化，慢病毒载体删除了与病毒包装和转导相关的基因，因而具有很高的生物安全性。适用于Cas9质粒DNA的递送。

当病毒转导靶细胞时，释放到宿主细胞中的病毒RNA借助逆转录酶逆转录成双链DNA，然后随机整合进宿主细胞的基因组中。在病毒载体中，位于两个LTR的DNA片段和病毒基因组都会稳定整合到靶细胞的基因组中。

02 腺病毒

腺病毒载体是应用较为广泛的病毒载体系统。腺病毒对大多数细胞都有很高的感染效率，包括分裂和不分裂细胞及原代细胞，除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。当腺病毒转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞，并以游离DNA的形式存在于细胞核中。由于腺病毒基因组不整合到宿主的基因组，所以腺病毒在宿主体内是瞬时表达。适用于Cas9质粒DNA的递送。

03 腺相关病毒

腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类无包膜的单链线状DNA病毒。具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、表达稳定等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一。当病毒转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞，线性双链DNA基因组以游离DNA的形式存在于细胞核中。其具有多种血清型，各种不同血清型的AAV载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。值得注意的是，AAV载体的最大包装容量仅为4.7kb，因此适用于Cas9质粒DNA的递送。如果需要递送体积庞大的Cas9蛋白即RNP体系时，需要使用体积较小的SaCas9蛋白或者将递送系统分割为两个载体等。

综合各病毒载体的特性，病毒载体较其他非病毒载体体系的优势在于较高的转染效率，尤其是在原代细胞和干细胞中，转染效率依然可以接近100%，可广泛适用于体内实验和体外实验，具有良好的泛用性。病毒载体劣势在于搭载的基因片段大小受限于病毒衣壳的结构大小，大片段基因难以通过这种技术导入细胞，病毒包装技术较为复杂、存在一定的生物安全问题。

通过不同的递送方式完成CRISPR/Cas系统的“最后一公里”，是影响基因编辑效率的关键。从电穿孔脉冲参数的毫秒级优化，到AAV衣壳的定向进化，递送技术的创新正不断拓展CRISPR的应用疆界。希望大家能根据自身的实验选择合适的Cas蛋白-sgRNA的生物形式，并选择适合的递送技术完成基因编辑实验。既然已经将基因编辑系统递送至细胞中启动编辑，那么要如何检测基因编辑后的效率呢？下期近岸蛋白将详细解析CRISPR/Cas系统的编辑效率验证技术！

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